翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式 ，在生命现象的许多关键调节机制中 ，蛋白质的磷酸化是重要的翻译后修饰 ，它与信号传导 、细胞周期 、生长发育以及癌症机理等诸多生物学问题密切相关 。因此 ，对于蛋白质磷酸化的研究对阐明蛋白质的功能具有重要意义 。

       磷酸化蛋白质组以组织 、细胞等较为复杂样本为研究对象 ，目的在于鉴定样品中发生磷酸化的蛋白质以及相应的位点 。对蛋白样本进行酶解 ，TiO2 富集磷酸化肽段 ，通过高分辨率 、高扫描速度的质谱进行大规模鉴定 ，利用得到的质谱谱图与相应数据库搜索比较 ，得到肽段序列结果 ，通过生物信息软件计算出磷酸化位点和定量信息 。

 

 

 

       Label free策略是根据一级质谱相关的磷酸化肽段峰强度 、峰面积 、液相色谱保留时间等信息 ，基于磷酸化肽段母离子强度（或色谱离子流的峰面积） ，以一级质谱MS1为定量基础 ，计算每个磷酸化肽段的信号强度在LC-MS色谱上的积分 ，进行磷酸化定量 。

|   技术路线

|   技术优势

1.  无需昂贵的同位素标记试剂 ，实验耗费低

2.  不受样本数量限制 ，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷

3.   对样本的操作少 ，从而使其最接近原始状态

|   样本要求

|   经典案例

      生物钟作为生物体内一种无形的时钟 ，控制着生物体内几乎全部的代谢过程 ，并且其自身会不断优化以保证生物体的稳态和代谢健康 。Robles等学者对小鼠肝脏的昼夜节律性磷酸化蛋白组进行了分析 ，结果发现 ，25%的磷酸化肽段 ，40%的磷酸化蛋白 ，其磷酸化水平出现显著的节奏性波动 。小鼠肝脏组织中共鉴定到20,404个磷酸化肽段,20,076个磷酸化位点, 4,461个磷酸化蛋白,且定量重复性较高 。磷酸化修饰组和蛋白组在一天之内的不同时期表达水平差异很大 ，并且磷酸化修饰组的表达差异更大 ，一天之内出现约5倍的表达差异 ，显著高于蛋白组变化的水平 。同时80%的磷酸化累积强度来自于20 %的磷酸化水平规律变化的蛋白 ，表明磷酸化水平振动的蛋白为调节蛋白而非结构蛋白 。

     研究人员进一步在CLOCK蛋白上发现了新的磷酸化位点S446和S440/441 (图6C) ，其磷酸化水平也出现周期性的变化 ，由于CLOCK蛋白表达量是恒定的 ，表明磷酸化水平的变化是调节该蛋白节律功能的主要因素 。上述结果均说明磷酸化依赖的信号通路对昼夜节律调节起主导作用 。通过KEGG通路富集分析 ，研究人员发现了昼夜节律相关的肝脏磷酸化蛋白质组富含来自代谢途径的蛋白质 。通过进行激酶-底物筛选等实验最终得出结论 ：小鼠体内的磷酸化周期是通过激活一组导致信号通路暂时整合的激酶来实现的 ，并最终调节影响细胞能量状态的代谢过程 。

|   相关文献

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