TMT是由美国Thermo Fisher 公司研发的一种多肽体外标记技术 ，最多可进行18例样本的蛋白质同批定量分析 。TMT试剂由肽结合基团 、平衡基团和报告基团三部分组成 ，可形成18 种等量异位标签 。具体实验流程及原理如下图 ：以5例样品的TMT标记定量检测为例 。在实验过程中将5例不同样品分别酶解成多肽片段→分别标记5种同位素标签→将5例标记好的多肽样品混合成1例总样品→进行HPLC分级（一般为10-15级）→分级后的多肽组分依次进入LC-MS/MS分析系统→二级MS阶段TMT平衡基团发生中性丢失 ，在低质量区产生多个报告离子→计算各报告离子峰面积 ，获得同一肽段不同样品间的相对丰度差异比值→加权计算肽段丰度获得总蛋白质相对定量值 。

|   TMT标记定量技术优势

       从TMT标记定量蛋白质组学技术基本原理和实验流程中我们可以看出 ，该技术将不同的样本分别标记独立的TMT标签 ，再等量混合成1例pool样进入质谱分析 。这种设计保证了所有样品均一性地经过质谱检测 ，从而防止了样品依次上样在质谱仪波动期引入的样品间系统误差 。因此 ，一般研究认为TMT标记定量蛋白质组学技术相较于非标记定量蛋白质组学技术 ，在蛋白质组定量比较方面更加准确 。

      同时 ，由于TMT实验将pool样进行HPLC分级处理 ，进行多次质谱进样 ，这样的实验流程不仅将进入质谱中样品的复杂度显著降低 ，从而减少了背景干扰 ，提高蛋白检出率 。同时 ，不同HPLC组分中会保留同一蛋白多肽 ，经过质谱重复鉴定 ，在定性和定量方面均可提高蛋白质组学的数据准确度 ，也提高了蛋白质组的鉴定深度 。因此 ，TMT标记定量蛋白质组学对于蛋白质组学深度检测需求的研究尤为适用 。

|   主要仪器设备

|   项目经验

      腾博会官网生物已经完成上百种类型样品的定量蛋白质组学检测 ，蛋白质组表达具有时空差异性 ，不同样本的蛋白谱各有特点 ，下图色块大小代表的是不同样本鉴定的蛋白数量差异 。

|   样品要求

|   应用方向

●   发病机理研究

●   药物靶点研究

●   疾病标志物筛选

●   植物品种改良

●   工程菌改造

●   特殊功能蛋白质筛选

|   经典案例

TMT技术发现脂肪代谢紊乱底层机理

2017年5月美国学者Pamir N等运用TMT标记技术成功完成了20例小鼠脂肪组织蛋白质组定量比较 。相关研究工作发表在蛋白质组学代表性杂志《Molecular & Cellular Proteomics》上（PMID: 28325852） 。该研究实验设计巧妙 ，突破了iTRAQ和TMT等体外标记蛋白组学技术在同位素标签数量上的限制 。

TMT蛋白质组学定量研究实验设计

研究人员将8周龄的20只小鼠处理分成四组（每组5只小鼠） ：分别低脂喂养8周和18周 ，高脂喂养8周和18周 。分别取各小鼠附睾脂肪组织进行3组TMT蛋白质组学定量分析 ，共计20例样品 ，通过3套TMT试剂“搭桥”方案完成了蛋白质组学定量分析 。将3组质谱数据校准后进行组间蛋白谱比较 ，获得衰老（aging）和高脂饮食（HF）调控的脂肪组织特征蛋白谱 ，重新认识衰老与高脂饮食诱导的代谢紊乱疾病的物质基础 ，具体实验设计 ，见图1 。

图1.多样本TMT蛋白质组学技术路线

高脂饮食易造成代谢紊乱

经过18个月高脂饮食喂养 ，小鼠出现了代谢状态系统性紊乱 ，随时间增长逐渐加剧 。在低脂状态下 ，衰老是引起代谢紊乱主要因素 ，但紊乱程度较高脂环境要轻 ，见图2 。

图2.高脂饮食和衰老造成糖脂代谢紊乱

蛋白质组改变伴随代谢紊乱发生

通过对比分析组间定量蛋白质组学数据的差异 ，研究人员发现衰老是引起蛋白质组变化的重要因素 。而在高脂环境下 ，衰老对于蛋白质组的调变影响将被放大 ，表现为代谢相关差异蛋白显著增多 。

图3.高脂饮食和衰老造成蛋白质组显著调变

      TMT定量蛋白质组学数据系统比较了衰老（Aging）和高脂饮食（HF）各自调控的脂肪组织特征蛋白谱 ，发现 ：低脂饮食条件下 ，衰老因素主要通过调控脂代谢 、氨基酸代谢相关蛋白群改变引发代谢紊乱 。而在高脂环境下 ，衰老对免疫系统 、补体激活 、基质重塑等蛋白群又产生了新的影响 ，造成了更严重的代谢紊乱发生 ，见如图4 。

图4.差异蛋白谱互作网络分析

小结

通过本文可以看出 ，蛋白质组学研究具有很大的发展空间 ，可以填补很多研究知识上的空白 。良好的实验设计可以突破技术限制 ，并让实验数据具有更强的说服力 。

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