CAR-T/CAR-NK疗法正在改变肿瘤治疗的前景 ，但其生产本身也面临一系列挑战 。与大多数药物不同 ，由于CAR-T疗法使用患者自己的T细胞 ，是高度个性化的 ，细胞治疗产品的质量在批次和患者之间存在显著差异 。在开发过程中 ，最重大的挑战之一是表征制备CAR-T产品的质量和效力 。腾博会官网生物利用IsoPlexis单细胞功能蛋白组学技术 ，可通过评价单个CAR-T细胞的多功能性 ，根据其功能定义细胞的质量 ，有效帮助研究者很好的迎接CAR-T生产工艺的评估和改进的挑战 。

 

 

 

图2  IsoLight单细胞蛋白质组分析系统成为CAR-T细胞生产工艺中的关键一环

       研究人员采用了两种生产制备方法 ，对比了不同的方法制备的CAR-T细胞的差异 。第一种方法（M1）在第5天以洗涤步骤终止转染 ，而第二种方法（M2）在第3天终止转染 。复苏的CAR-T细胞用抗CD4或抗CD8磁珠分选 ，并与表达CD19或CD22抗原的靶细胞共培养 。去除靶细胞后 ，将CAR-T细胞悬液载入IsoCode单细胞蛋白质组芯片 ，捕获单细胞的细胞因子信号 ，数据使用IsoSpeak软件进行分析（图 3） 。

              图3  Isoplexis分析CAR-T细胞的基本流程

       结果表明 ，无论是靶向CD19还是CD22的CD4+或者CD8+的CAR-T细胞产品 ，使用M2方法制备得到的细胞 ，细胞多功能指数更高(图4) 。即使用M2制备的CAR-T产品表现出更高的多功能性 ，也表现在效应性因子和刺激性细胞因子的增加 。这一单细胞多功能数据清楚地表明 ，与之前使用的M1相比 ，M2显著改善了双特异性CD19/CD22 CAR-T细胞产品的功能 。

 图4  单细胞多功能性用于评估不同制备方法得到的CAR-T细胞产品

|   技术优势

       考虑到细胞治疗产品生成跟品质 ，细胞治疗行业从细胞处理工作流程 ，细胞分离 、细胞培养到最终细胞产物的配方都需要更多自动化的流程 。IsoPlexis的IsoLight单细胞因子检测系统采用全自动检测的工作方式和端到端(End-to-end)工作流程 ，包含细胞培养 ，捕获因子信号 ，多重因子检测 ，影像数据读取及导出 。简单直观的IsoSpeak多维生信分析软件 ，无需特别培训生信分析人员来进行数据分析 。大幅提高工程细胞产品开发和流程的优化 。

|   经典案例 （点击可观看视频）

      早在2018年一篇Blood杂志文章中研究了治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)靶向CD19 CAR-T细胞 ，检测了在输注前CAR-T细胞的多功能性及PSI指数 ，并发现与临床结果有正相关性 。研究表明 ，这些患者输注前CAR-T的多功能性与患者接受治疗后的客观反应(OR)和细胞因子释放综合征(CRS)具有统计学正相关性 ，通过单细胞体外实验能够预测临床治疗结果及不良反应 。PSI可以有效区分对治疗有应答者和无应答者（图5） 。

 图5  CAR-T细胞PSI与患者预后具有显著相关性

       2020年Gastroenterology杂志发表一项CAR-T改良方法靶向实体瘤的研究 。研究对比分析了靶向肝细胞癌高表达 的GPC3两个不同抗原表位的CAR-T功效 。研究者首先体外实验发现了靶向hYP7的CAR-T细胞比靶向HN3的CAR-T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力 。为了佐证这一结果 ，研究者采用了Isoplexis单细胞功能蛋白组分析两种CAR-T细胞 ，结果发现了hYP7-CAR-T细胞具有更高的多功能性指数（PSI） 。Isoplexis分析结果和体外效能相一致 ，为下一步的体内实验提供了重要的质控评估依据 。最终的体内实验也证实了hYP7-CAR-T细胞具有更强的抑制和消除肿瘤细胞的能力（图6） 。

 图6  单细胞功能蛋白组作为CAR-T细胞功效的质量评估指标

|   相关文献

[1]. Spiegel JY, Patel S, Muffly L, Hossain NM, Oak J, Baird JH et al. CAR T cells with dual targeting of CD19 and CD22 in adult patients with recurrent or refractory B cell malignancies: a phase 1 trial. Nat Med. 2021;27(8):1419-1431.
[2]. McKenna MK, Englisch A, Brenner B, Smith T, Hoyos V, Suzuki M et al. Mesenchymal stromal cell delivery of oncolytic immunotherapy improves CAR-T cell antitumor activity. Mol Ther. 2021;29(5):1808-1820.
[3]. Fousek K, Watanabe J, Joseph SK, George A, An X, Byrd TT et al. CAR T-cells that target acute B-lineage leukemia irrespective of CD19 expression. Leukemia. 2021;35(1):75-89.
[4]. Thomas A, Sumughan S, Dellacecca ER, Shivde RS, Lancki N, Mukhatayev Z et al. Benign tumors in TSC are amenable to treatment by GD3 CAR T cells in mice. JCI Insight. 2021;6(22):e152014.
[5]. Roselli E, Boucher JC, Li G, Kotani H, Spitler K, Reid K et al.  4-1BB and optimized CD28 co-stimulation enhances function of human monospecific­and­bispecific­third generation­CAR­T­cells. J Immunother Cancer. 2021;9(10):e003354.
[6]. Li D, Li N, Zhang YF, Fu H, Feng M, Schneider D et al. Persistent Polyfunctional Chimeric Antigen Receptor T Cells That Target Glypican 3 Eliminate Orthotopic Hepatocellular Carcinomas in Mice. Gastroenterology. 2020;158(8):2250-2265.e20.
[7]. Schmidts A, Ormhøj M, Choi BD, Taylor AO, Bouffard AA, Scarfò I et al. Rational design of a trimeric APRIL-based CAR-binding domain enables efficient targeting of multiple myeloma. Blood Adv. 2019;3(21):3248-3260.
[18. Rossi J, Paczkowski P, Shen YW, Morse K, Flynn B, Kaiser A et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 2018;132(8):804-814.