本研究于2019年发表在Thorax杂志 (IF:9.130)¹ 。研究者入组了6例特发性肺纤维化 (IPF ，Idiopathicpulmonary fibrosis)患者和6例健康受试者（HS ，healthy subjects） ，使用超速离心法分离其痰液中的外泌体 。随后 ，通过miRNA芯片分析鉴定到21个差异表达的miRNA（7个miRNA上调 、14个miRNA下调）（图1A） ，并通过入组10例IPF和8例HS的独立样本（cohort 2） ，结合前面测序的6例IPF和6例HS（cohort 1） ，共16例IPF和14例HS ，采用qPCR对差异最显著的三种miRNA（miR-33a-5p 、miR-142-3p 、Let-7d-5p）进行了表达水平的验证 。

接着 ，通过ROC曲线对上述几个差异miRNA进行了诊断效能的评估 ，考虑年龄和性别（Model1 ：age and sex） ，发现联合使用3种miRNA时的AUC达0.978（图1B） 。并且外泌体miR-142-3p和let-7d-5p 与IPF患者的肺功能指标一氧化碳/肺泡容积 (DLCO/VA)具有显著相关性 。这些结果表明了外泌体miRNA可能用于IPF的检测和诊断 。

本研究在今年发表于BriefBioinform杂志（IF:11.620）³ 。研究者对感染结核分枝杆菌H37Ra（Mycobacterium tuberculosis H37Ra） 、牛分枝杆菌BCG （Mycobacterium bovis BCG） 、肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia） ，以及未感染的THP-1诱导的巨噬细胞（THP-1-derived macrophages）培养基采用超速离心法分离其中的外泌体 。随后 ，通过small RNA-Seq总共鉴定到495个的miRNA 。通过比较Exo-Ra 、Exo-BCG 、Exo-Control ，设置fold change > 2.0 或 < 0.5 ，reads > 200 ，进行差异表达筛选 ，发现12个在Exo-Ra组和Exo-BCG组均上调的miRNA和2个在Exo-Ra组和Exo-BCG组均下调的miRNA（图3A） 。

随后作者选择miR-185-5p（fold change value >5.0且reads >200的miRNA） ，通过qPCR发现在THP-1诱导的巨噬细胞和PBMCs中单核细胞感染模型中miR-185-5p在感染组外泌体中上调 ，同时通过临床血浆样本来源的外泌体（入组20例TB患者 、17例健康受试者）也验证了这一结果 。最后 ，通过ROC曲线对外泌体miR-185-5p进行了诊断效能的评估 ，发现AUC达0.978 ，敏感性50% ，特异性93.75%（图3B） 。结果表明外泌体miR-185-5p或可用作结核病诊断的生物标志物 。

本研究在2020年发表于Allergy杂志（IF:13.143）⁴ 。首先 ，研究人员入组了16例健康受试者（HC ，healthy controls） 、15例轻中度哮喘患者（AM ，mild-to-moderate） 、14例重度哮喘患者（AS ，severeasthma） 。采用尺寸排阻法（Size exclusion chromatography）分离血浆中的外泌体 。随后通过small RNA-Seq对血浆中的外泌体进行分析 ，鉴定到139个的外泌体miRNA（≥10 reads）,其中AM  、AS 、HC分别为115 、114 、128个 。此外 ，AS相较于HC ，miR-122-5p 、miR-191-5p显著上调 ，同时miR-3168是显著下调的（图4A 、B） 。

接着 ，研究人员每组重新入组了10例独立样本 ，加上前面入组的用于筛选的样本（HC ，n=16；AM ，n=15；AS ，n=16） ，共计26例HC 、25例AM患者 、26例AS患者 ，通过qPCR对血浆外泌体中上面提到的3种miRNA进行验证 ，发现miR-122-5p显著上调 ，miR-191-5p无显著改变 ，miR-3168未能检测到 。最后 ，作者做了一个试验性质的实验（in a pilotapproach） ，入组了4例HC 、10例哮喘患者（AM或AS） ，qPCR实验发现其痰液外泌体中miR-122-5p和miR-191-5p也发生显著上调 。结果表明miR-122-5p在哮喘患者血浆和痰液外泌体中均显著上调 ，或可用作哮喘的生物标志物 。

1）针对外泌体的分离 ，上述文章采用了超速离心法 、试剂盒法（ExoQuick^™ 、Exo-Spin™）以及尺寸排阻法（SEC） 、这些方法在原理上有所不同 ，提取外泌体质量方面各有特色 ，腾博会官网提供包括上述方法在内的多种外泌体提取服务 ，如腾博会官网生物自主研发的EIQ3试剂盒可以实现血清 、血浆 、尿液 、细胞上清等液质样本中外泌体的快速提取 ，并且测序数据质量与经典的超速离心最为接近 ，具体对比数据详见文献“Isolation of extracellular vesicle with differentprecipitation-based methods exerts a tremendous impact on the biomarkeranalysis for clinical plasma samples” 。

2）关于差异miRNA的筛选 ，通常我们会采用商用试剂盒或TRIzol进行外泌体RNA的提取 ，然后采用Small RNA-Seq或miRNA 芯片的方法确定差异表达的miRNA ，以上两种技术策略腾博会官网生物均可以提供 。

3）最后关于差异miRNA的验证 ，虽然文章中应用的是普通qPCR ，但是在实际研究中 ，我们并没有足够的样本进行多个miRNA的验证 ，一般情况1mL血浆分离的外泌体RNA利用普通qPCR方法仅够3-5个miRNA的验证 。而腾博会官网生物提供数字PCR（ddPCR） ，其反应体系和灵敏度是qPCR的10倍以上 ，因此 ，ddPCR特别适用于外泌体miRNA尤其是低丰度RNA表达的验证分析 。

4）上述文章能在高分杂志上发表的可能原因 ：案例1主要特点在于 ，首先采用痰液的外泌体来检测特发性肺纤维化 ，痰液样本类型独特 。案例2在于其入组患者类型 ，无人报道过非吸烟者 、吸烟者 、COPD之间的外泌体差异 。案例3在于其细致的生物信息数据挖掘 ，及临床样本验证 ，案例4在于其思路完整 ，样本量相对较多 。总之 ，选择样本类型时 ，我们可以尝试除血浆外的其他体液 ，在入组患者时 ，我们尽量区分不同亚型 ，在高通量筛选标志物后 ，我们尽可能进行大样本的验证工作 ，这些手段都将对提升文章档次有一定的帮助 。

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