上篇我们介绍了外泌体膜蛋白可以作为靶向运输分子及载药支架分子 ，今天我们继续通过两篇精彩案例介绍外泌体膜蛋白的临床应用潜能 。

|   案例一:基于外泌体膜蛋白的治疗靶点研究

图1.外泌体ITGβ₁在NASH中的作用机制

研究者首先分离了原代小鼠肝细胞（PMH）培养上清的外泌体 ，然后通过外泌体蛋白质组学分析发现了脂毒性肝细胞来源的外泌体（LPC-EV）高表达很多整合素蛋白（图2A） ，之后利用WB 、免疫胶体金电镜和纳米流式多种技术验证了整合素蛋白ITGβ₁显著性的高表达在LPC-EV中（图2B-D） 。最后研究者利用纳米流式技术发现了NASH病人血清外泌体中ITGβ₁的表达也显著高于其他轻度脂肪变性病人（图2E） ，或许可以作为NASH的诊断标志物 。

图2.蛋白质组学发现酒精性脂肪肝细胞来源的外泌体富含ITGβ₁蛋白

研究者后续先阐明了ITGβ₁可以通过受体内吞途径进入外泌体 ，之后开展了深入的功能研究 。研究者发现了标记DiO的LPC-EV可以被单核细胞摄取 ，并且可以促进单核细胞粘附于肝窦内皮细胞（LSEC）（图3A） ，与其一致的是转录组测序结果发现了LPC-EV处理的LSEC中很多和细胞粘附相关的基因表达显著上调（图3B） 。不管是利用anti-ITGβ₁中和外泌体ITGβ₁表达 ，还是缺失ITGβ₁细胞来源的外泌体都会减弱促单核细胞粘附的作用效果（图3C） ，证实了外泌体是通过ITGβ₁发挥作用 。基于外泌体ITGβ₁的体外作用效果 ，研究者在饮食引起的NASH小鼠模型腹腔注射ITGβ₁抗体 ，结果发现了ITGβ₁抗体可以减轻NASH小鼠肝脏炎症 、单核巨噬细胞的侵润 、细胞凋亡和纤维化（图3D-G） ，说明了ITGβ₁或许可以作为NASH治疗的潜在靶点 。

图3. 外泌体ITGβ1可以作为NASH治疗的潜在靶点

|   案例二:基于外泌体膜蛋白的抗病毒研究

新冠病毒（SARS-CoV-2）的刺突蛋白spike (S)可以直接和宿主细胞ACE2受体结合 ，阻止S和ACE2的结合是抑制病毒入侵 ，治疗COVID-19疾病的潜在手段 。近期苏州大学周芳芳教授和浙江大学张龙教授团队在材料学领域的顶级期刊Advanced Materials（IF: 30.849）发表了一项基于外泌体膜蛋白ACE2中和新冠病毒和宿主细胞结合的研究² 。他们发现蛋白棕榈酰化是ACE2分泌进外泌体的关键调控因素 ，基于此他们构建了高度棕榈酰化的ACE2（PM-ACE2）使其大量分泌到外泌体中 ，之后载有PM-ACE2的外泌体（PM-ACE2-EV）可以竞争性结合SARS-CoV-2的S蛋白 ，阻止与宿主细胞的结合 ，减少病毒入侵（图4） 。

图4.外泌体ACE2蛋白可以中和病毒和宿主细胞的结合

研究者首先通过外泌体蛋白质组学确定了在Vero-E6细胞和MCF7细胞来源的外泌体中可鉴定到ACE2蛋白 ，但在HEK293T细胞的外泌体中并没有鉴定到（图5A） ，后续WB也进行了验证（5B） 。之后利用免疫胶体金电镜和ELISA验证了ACE2蛋白表达在外泌体膜上（图5C,D） 。重要的是研究者通过表面生物素化实验发现了病毒感染细胞会诱导细胞质膜上的ACE2进去外泌体膜上（图5E） 。为了揭示调控ACE2蛋白进去外泌体的机制 ，研究者利用靶向蛋白翻译后修饰的286个小分子抑制剂处理Vero-E6细胞 ，检测外泌体中ACE2的表达量 。结果发现了棕榈酰化抑制剂2-bromopalmitate (2-BP)可以显著抑制ACE2进去外泌体 ，同时去棕榈酰化酶APT1的抑制剂ML348却可以显著促进外泌体中ACE2的表达（图5F） ，之后研究者开展了深入的机制研究 ，发现了ACE2关键的棕榈酰化位点 ，并且特异性的受到棕榈酰化转移酶ZDHHC3和去棕榈酰化酶LYPLA1的调控 。总而言之 ，这些结果说明了ACE2的棕榈酰化是其分泌进外泌体中的关键调控因素 。

图5.ACE2分泌到外泌体中受到蛋白棕榈酰化的调控

基于以上的发现 ，研究者构建了过表达质粒 ，将一段棕榈酰化的靶序列MLCCMRRTKQV融合到ACE2的N端（PM-ACE2）（图6A） ，然后转染到MSC细胞 ，收集细胞外泌体 ，通过流式 、免疫电镜和 ELISA验证了相比转染野生型ACE2的细胞 ，转染PM-ACE2的细胞外泌体中会有更多的ACE2的表达（图6B） 。之后研究者利用表面等离子共振（SPR）和竞争ELISA实验证明了载有PM-ACE2的外泌体（PM-ACE2-EV）可以更加高效的结合病毒S蛋白 ，封闭S蛋白与ACE2蛋白的结合（图6C,D） 。

图6.PM-ACE2-EV可以结合病毒S蛋白

最后研究者检测了PM-ACE2-EV体内中和病毒的作用 ，发现了预先处理PM-ACE2-EV可以显著减少SARS-CoV-2对机体的感染（图7A） ，减少体内多个组织中病毒RNA的含量（图7B） 。

图7.PM-ACE2-EV可以阻止病毒入侵

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|   参考文献

1.  Guo Q, Furuta K, Lucien F, Gutierrez Sanchez LH, Hirsova P, Krishnan A et al. Integrin b1-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. J Hepatol. 2019;71(6):1193-1205.