图4 ：外泌体蛋白质组学分析

|   案例二:蛋白质组学应用于烟雾病相关的外泌体研究中

烟雾病是一种病因不明 、大脑血管慢性进行性狭窄或闭塞为特征 ，并继发颅底异常血管网形成的脑血管疾病 。近期来自解放军总医院第五医学中心和北京协和医学院的研究人员对烟雾病病人血清外泌体开展了功能研究 ，相关成果发表于该领域权威期刊Stroke（IF: 7.914）² 。研究者纳入了132个烟雾病病人包括77个缺血性病人（ischemic）和55个出血性病人（hemorrhagic） ，以及22个健康对照 。研究人员对血清来源的外泌体开展了TMT蛋白质组学分析和细胞功能实验（图5） 。

图5 ：烟雾病血清外泌体功能实验及蛋白质学分析

qEV或者TEI试剂盒收集的血清外泌体开展细胞功能实验 ，结果发现烟雾病人血清来源的外泌体可以显著促进小鼠脑血管内皮细胞的增殖 ，出血性烟雾病人血清外泌体（Hemo）的作用效果最显著 。为了解释外泌体对脑血管内皮细胞的作用机制 ，研究者对外泌体处理的细胞开展了TMT蛋白质组学分析 。细胞的TMT蛋白质组总共鉴定了6516个蛋白（unique peptides≥2） ，相比其他两组 ，在出血性血清外泌体处理的细胞中鉴定了17个下调的蛋白（Cluster 1）和32个上调的蛋白（Cluster 2）（图6A） 。GO和WikiPathway富集分析发现了这些差异蛋白大多属于线粒体及相关的成分（图6B 、C） 。由此可推测出血性烟雾病人血清来源的外泌体主要通过影响脑血管内皮细胞的线粒体功能絮乱发挥作用 ，为后续再开展深入的机制研究锁定了潜在的作用靶点 。

图6 ：TMT蛋白质组学分析外泌体处理的脑血管内皮细胞

烟雾病病人血清外泌体上述作用的功能分子是什么？研究人员对超离收集的正常 、缺血性和出血性烟雾病人血清外泌体进行了两组重复的TMT蛋白组实验（图5） ，两组分别鉴定了890个和1128个血清外泌体蛋白（unique peptides≥2） ，其中两组实验共同鉴定到了859个外泌体蛋白 。与正常血清外泌体对比 ，缺血和出血烟雾病人血清外泌体共有231个差异蛋白 。GO分析这些上述差异蛋白发现了24.8%（57个）的蛋白与细胞生长及维持有关 ，彼此间可以形成紧密的互作网络（图7） ，由此可推测烟雾病人血清外泌体调控脑血管内皮细胞增殖等效果或许通过传递这些通路蛋白发挥其作用 。

图7 ：外泌体蛋白质组学分析

|   案例三:多组学分析真菌感染的巨噬细胞来源的外泌体的功能成分

新生隐球菌（Cryptoccus neoformans）在免疫力低下的人群中会引起肺和脑亚急性或慢性感染 。来自上海长征医院联合国内外多家科研机构的研究人员通过多组学联合分析了新生隐球菌感染的巨噬细胞释放的外泌体的功能组分 ，相关成果近期发表于该领域的权威期刊mBio（IF: 7.867）³ 。研究人员首先收集了正常小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM） 、灭活菌感染的BMDM细胞以及活菌感染的BMDM细胞分泌的外泌体 ，对比分析正常BMDM细胞在被上述三类外泌体处理后的抗真菌活性 ，结果发现了在活菌感染来源的外泌体处理之后具有更显著的抗真菌能力（图8 A） 。为了揭示正常巨噬细胞在受到外泌体处理后分子层面的改变 ，研究人员通过转录组学分析了外泌体处理和不处理的小鼠BMDM细胞及人外周血来源的巨噬细胞（MDM）的差异基因表达（图8 B） ，GO分析发现了两类细胞的差异基因很多都和细胞周期和分裂相关 ，说明了真菌感染的巨噬细胞来源的外泌体可能通过影响正常巨噬细胞的细胞周期相关通路发挥作用 。

图8 ：转录组分析外泌体处理的巨噬细胞

为了对比上述不同处理BMDM细胞来源的外泌体中成分差异性 ，研究人员对上述三种来源的外泌体开展了蛋白质组学 、脂质组学和代谢组学的分析 ，总共鉴定了1481个蛋白 ，226个脂类和59个代谢产物 。蛋白质组学分析鉴定了三组之间有46个差异蛋白（图9 A） 。脂质组学分析发现了最显著差异的脂类包括磷脂酰胆碱（PC） 、磷脂酰乙醇胺（PE）和鞘磷脂（SM）（图9 B） 。代谢组学分析却发现各组之间外泌体中并没有显著差异的代谢物 ，这些结果表明了新生隐球菌感染的巨噬细胞来源的外泌体发挥其作用可能主要依赖于外泌体载有的蛋白或者脂质的分子功能 。

图9 ：外泌体蛋白质组和脂质组学分析